Étiqueter les protéines exportées par les bactéries invasives pour les suivre à la trace

Le Système FAST : un indicateur fluorescent permettant de suivre la position de protéines sécrétées par les bactéries

L’étude dynamique et la compréhension des interactions entre les bactéries et leur environnement nécessitent de se doter d’outils permettant de suivre en temps réel les populations bactériennes et les protéines qu’elles sécrètent. 

Grâce au système FAST, des chercheurs ont découvert de manière surprenante que les bactéries comme Listeria monocytogenes peuvent se multiplier de deux manières différentes dans une cellule-hôte. Elles s’avèrent en effet capables d’adopter une stratégie alternative du scenario classique pour coloniser celle-ci.

Le principe du système FAST est celui d’un indicateur fluorescent permettant de suivre la position d’une protéine. Il est constitué de deux parties qui s’associent de façon réversible : une protéine nommée FAST et un composé soluble appelé fluorogène.

« Lorsque le fluorogène se lie à cette protéine FAST, ses propriétés physicochimiques sont modifiées et le complexe fluorescent se teinte d’une couleur précise. En plaçant en tandem le gène qui code FAST et celui de la protéine qui nous intéresse, on obtient une fusion entre FAST et cette protéine. On peut alors suivre par microscopie ses déplacements grâce à la fluorescence émise. » explique Alice Lebreton, chercheuse en biologie moléculaire et microbiologiste à l’INRAE et responsable d’équipe à l’Institut de biologie de l’ENS-PSL (IBENS).

Classiquement, les biologistes visualisent les protéines en les fusionnant à la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses analogues. Mais comme le précise Arnaud Gautier, professeur à Sorbonne Université, chémobiologiste au Laboratoire des Biomolécules et développeur de la technologie FAST, cette solution compte quelques désavantages : « bien que la technique de marquage GPF constitue l'une des techniques les plus puissantes pour l'imagerie des protéines dans les cellules vivantes, les protéines fluorescentes présentent des limites spécifiques qui empêchent leur utilisation sans restriction pour l'imagerie moléculaire : leur taille et leur tendance à l'oligomérisation (1) peuvent conduire à des fusions dysfonctionnelles, leur longue maturation peut empêcher l'étude des processus dynamiques, et leur besoin en dioxygène empêche l'imagerie de processus anaérobies. »

De plus, la GFP ne peut pas être transportée efficacement de l’intérieur vers l’extérieur des bactéries, et par conséquent ne permet pas d’observer les protéines que les micro-organismes exportent vers leur surface ou sécrètent dans leur environnement.

« Pour obtenir une spécificité de marquage comparable aux protéines fluorescentes tout en contournant leurs limites, nous avons donc développé une petite protéine, appelée FAST (Fluorescence-Activating and absorption-Shifting Tag), capable de former un assemblage fluorescent non covalent (2) avec des dérivés substitués de 4-hydroxybenzylidène rhodanine (HBR) appelés fluorogènes. » détaille Arnaud Gautier.

Ces fluorogènes présentent une fluorescence essentiellement indétectable en solution ou dans les cellules. Ceci permet d’imager des protéines fusionnées à FAST sans qu'il soit nécessaire de laver le ligand (3) libre en excès, facilitant ainsi l'étude de processus dynamiques et l'imagerie des organismes multicellulaires.

Comme l’explique Arnaud Gautier, FAST présente plusieurs avantages par rapport aux autres protéines fluorescentes : « il s’agit d'une petite protéine de 14 kDa (4) ayant une empreinte génétique réduite, qui fluoresce instantanément, fonctionne en l’absence de dioxygène et, comme nous le montrons dans cette nouvelle étude, reste pleinement fonctionnelle après sécrétion par les bactéries. Ce dernier point fort permet donc de visualiser les protéines que les bactéries utilisent pour interagir avec leur environnement. »

Les chercheurs ont aussi montré que la protéine FAST peut être sécrétée pour plusieurs espèces de bactéries, même lorsqu’elles utilisent des mécanismes d’export très différents. Une fois dehors, la liaison entre FAST et le fluorogène reconstitue la fluorescence. Comme première application, les chercheurs ont suivi par vidéomicroscopie une toxine produite par Listeria monocytogenes, la bactérie pathogène responsable de la listériose, lors de l’invasion de cellules humaines.

Découverte : deux scénarios sont possibles lors de l’infection d’une cellule par Listeria monocytogenes

Au cours de son cycle infectieux, Listeria entre dans les cellules humaines avant de s’y multiplier. Sa capacité à pénétrer dans la plupart des cellules lui permet de franchir les barrières protectrices de l’organisme telle que la muqueuse intestinale, mais aussi de circuler dans le corps à bord de cellules immunitaires infectées.
 

« Dans le scénario classique que l’on connaissait explique Alice Lebreton, les bactéries qui pénètrent dans les cellules se retrouvent d’abord emprisonnées à l’intérieur de vacuoles — des compartiments séparés du reste de la cellule par une membrane — puis s’en échappent en quelques minutes, et ne se multiplient qu’une fois parvenues dans le cytosol — le milieu intracellulaire. »
Les travaux des chercheurs montrent que Listeria peut adopter une seconde stratégie : rester plusieurs heures dans les vacuoles et s’y multiplier, à la même vitesse que dans le cytosol.

« Étonnamment, c’est une seule et même toxine — la listériolysine O que nous avons observée avec FAST—, qui aide Listeria à sortir des vacuoles en déstabilisant la membrane, et qui lui permet par ailleurs de se multiplier lorsqu’elle reste dans les vacuoles poursuit Alice Lebreton. En disposant de plusieurs niches de multiplication dans les cellules, Listeria a potentiellement plusieurs cordes à son arc pour échapper aux défenses que la cellule-hôte met en place contre elle. »

Une découverte qui ouvre de nouvelles perspectives à l’observation et l’analyse des pathogènes, comme le souligne la microbiologiste : « Il s’agit maintenant d’étudier quels avantages confère cette nouvelle niche à la bactérie, si elle favorise la pathologie sous une forme aigüe ou chronique, perturbe la réponse immunitaire, ou participe à la colonisation de certains tissus ou organes. »

Croissance de Listeria monocytogenes à l'intérieur de vacuoles ou dans le cytosol des cellules épithéliales intestinales. Vue au microscope à épifluorescence de cellules d'adénocarcinome du côlon humain infectées par une souche de Listeria monocytogenes qui exprime constitutivement la protéine fluorescente mCherry (rouge). Les bactéries cytosoliques sont entourées d’un manteau d'actine (une protéine du squelette cellulaire dont elles stimulent la polymérisation), marqués par la phalloïdine fluorescente (vert), tandis que les bactéries qui se développent à l'intérieur des vacuoles apparaissent sous la forme d’agrégats arrondis rouges et sont dépourvues de d’actine. Les noyaux ont été marqués par la coloration de l’ADN au DAPI (bleu). © Caroline Peron-Cane (2020).

Par différentes approches et à différentes échelles, les chercheurs vont désormais tenter de comprendre l’utilité et la manière dont ces niches de multiplication se forment et perdurent. Ils vont ainsi poursuivre la caractérisation à l’échelle moléculaire et cellulaire, pour déterminer les mécanismes qui permettent à la bactérie de se multiplier à l’intérieur des vacuoles, dans certaines cellules et pas dans d’autres.

Ils étudieront aussi si les capacités de détection de l’infection par la cellule hôte varient, suivant que les bactéries restent dans des vacuoles ou atteignent le cytosol. Enfin, ils étendront leurs travaux à l’influence de la prolifération intravacuolaire sur l’infection à l’échelle des tissus et de l’organisme, par des approches in vivo et de modélisation.

« La poursuite du projet avec Nicolas Desprat au département de physique, et la participation de l’unité dirigée par Marc Lecuit à l’Institut Pasteur nous permettront d’aborder ces différentes échelles de front. » projette Alice Lebreton, enthousiaste à l’idée d’une nouvelle collaboration interdisciplinaire.

Un projet interdisciplinaire à la croisée des départements de biologie, physique et chimie de l’École

Car cette étude n’aurait pu être réalisée sans le concours et la parfaite articulation des connaissances et des savoir-faire des chercheurs en biologie, chimie et physique, comme l’explique la chercheuse : « en 2009, j’avais essayé d’utiliser la GFP pour suivre des protéines sécrétées par Listeria et constaté, comme bien d’autres microbiologistes, que l’outil n’était pas adapté. J’avais alors abandonné l’idée, jusqu’à mon arrivée à l’IBENS fin 2014. ».

Mais lors d’un séminaire de recherche, Arnaud Gautier présente le système FAST dont son groupe achevait le développement (Plamont et al., PNAS 2016). Pour Alice Lebreton, c’est le déclic : « c’était potentiellement la solution dont j’avais besoin ».

FAST permet de lever l’obstacle technique. De premiers résultats encourageants sont rapidement obtenus, et les chercheurs décident alors de poursuivre l’adaptation de FAST à leurs travaux. « Dans le même temps, la discussion est amorcée avec le physicien Nicolas Desprat qui s’intéressait à la dynamique des protéines adhésives à la surface des bactéries, poursuit la scientifique. Certaines des questions que nous nous posions, sur les mécanismes d’échanges moléculaires entre plusieurs bactéries, ou entre bactéries et cellules hôtes, convergeaient ; la possibilité d’observer les phénomènes dans le temps par vidéomicroscopie était au carrefour de nos centres d’intérêt, et FAST permettait de s’y lancer. »

L’expertise en imagerie de fluorescence de Nicolas Desprat a servi à mettre au point un protocole permettant de limiter la phototoxicité. « L’aspect quantitatif de ma discipline nous a poussé à tracer la distribution des temps de vie des vacuoles plutôt que de nous intéresser uniquement à la valeur moyenne explique le chercheur. Ainsi, nous avons pu déceler la présence d’une longue queue, témoignant d’un nombre significatif d’événements à temps long et montrant que des vacuoles peuvent perdurer longtemps avant de se rompre. »

Grâce au programme Interfaces pour le vivant (Sorbonne Université), Caroline Peron-Cane, désormais post-doctorante à l’INRAE, a consacré une thèse au sujet (thèse co-encadrée en microbiologie et physique). « Ce travail, c’est essentiellement le sien » tient à préciser Alice Lebreton. « La proximité des laboratoires de biologie (IBENS), de physique (LPENS) et de chimie (Laboratoire PASTEUR) de l’École lui a permis de réaliser le projet là où c’était le plus approprié… Elle a dû traverser la rue des milliers de fois, mais pour le suivi de près et les échanges, cette organisation de la recherche est idéale. »

Les trois chercheurs, s’ils appartiennent à des établissements de tutelles différents, travaillent tous dans des laboratoires rattachés à l’ENS-PSL. Au-delà de la proximité géographique des différents départements de l’École, ils apprécient particulièrement l’interdisciplinarité dont ils ont pu mesurer combien elle était encouragée au sein de l’établissement.

Comme l’explique Alice Lebreton : « trouver sur un même site des départements à taille humaine, dans différents champs, crée plus qu’ailleurs des rencontres entre disciplines, permettant de développer des projets sans doute plus originaux que dans un environnement où la plupart partagent une expertise plus semblable. » La chercheuse tempère cependant : « ceci a une contrepartie : une moindre mutualisation des équipements, ou une moindre densité d’échanges sur une thématique donnée. Il n’y a sans doute pas d’équilibre parfait ; celui-ci convient plutôt bien à ma façon de travailler. »

« Ce lieu unique où se rencontrent les chercheurs sans barrières disciplinaires permet d’accélérer leurs découvertes et nourrit leur créativité. » Arnaud Gautier

« L’ENS est un lieu où se cultive à la fois l’excellence mais aussi et surtout l’interdisciplinarité. Il est très pratique de pouvoir traverser des couloirs, voir une rue pour aller discuter avec ses collègues, confie Nicolas Desprat, pour qui les moments informels sont aussi importants que les autres dans le travail de recherche. Pouvoir se voir et se croiser permet de se donner la force de continuer, juste par le simple fait de pouvoir relancer l’autre au détour d’un couloir sans pour autant l’oppresser. C’est un atout considérable ».

L’importance de poursuivre et encourager l’interdisciplinarité dans l’enseignement et la recherche

Et pour Alice Lebreton, Nicolas Desprat et Arnaud Gautier, les bénéfices à croiser leurs disciplines sont multiples.  La microbiologiste considère que la compétence et la complémentarité méthodologiques sont centrales : « disposer d’un nouvel outil comme FAST, c’est pouvoir répondre à des questions de biologie qui restaient ouvertes ; pouvoir analyser quantitativement nos observations également. Les problématiques elles-mêmes évoluent, du fait des interactions ; parce que l’on a chacun notre bagage de culture scientifique, on voit un problème sous un autre angle, on soulève par exemple des questions de concentration, de contraintes physiques, qui amènent à formuler de nouvelles hypothèses à tester. C’est ainsi, par exemple, que nous est venue l’idée d’utiliser l’accumulation de FAST dans les vacuoles d’entrée pour mesurer leur durée de vie. »

Le chémobiologiste Arnaud Gautier insiste sur la réciprocité des apports entre chimie et biologie : « la complexité des systèmes biologiques apparaît comme le terrain de jeu ultime en termes de réactivité chimique et de défis analytiques, et représente donc une source d’inspiration et d’innovation infinie. D’autre part, pour les biologistes, la chimie apparaît comme le niveau de description le plus approprié pour comprendre les processus biologiques à l’échelle moléculaire, et apporte des technologies innovantes pour sonder le vivant avec une résolution spatiale et temporelle sans précédent. »

Quant au physicien Nicolas Desprat, la biologie est selon lui la science des systèmes ouverts (échangeant matière et énergie avec l’extérieur) alors que la physique est la science des systèmes isolés. Pour lui, les bénéfices de croiser les deux disciplines sont certes considérables mais les interactions souvent à sens unique : « La physique relève, qui d'une démarche réductionniste, est une approche intéressante en biologie car amenant de la simplification dans la description des systèmes biologiques qui sont très complexes. Ainsi, la rencontre entre ces deux disciplines est souvent très féconde mais a malheureusement tendance à ne s'observer que dans un sens : de la physique vers la biologie. »

 « Aujourd’hui, l’ENS est en train de se doter d’espaces pour promouvoir les échanges entre chimie, mathématiques, physique, biologie et sciences cognitives. » Nicolas Desprat

Mais s’il y a bien une chose sur laquelle les trois chercheurs sont unanimes, c’est l’importance de poursuivre et d’encourager davantage encore cette interdisciplinarité : « Les problèmes scientifiques sont de plus en plus complexes. Et le principal défi de demain est de gagner en niveau d’intégration dans la compréhension d’un système. Cela demande de maîtriser les différents aspects d’un même problème et cela requiert bien souvent une approche pluridisciplinaire. » estime Nicolas Desprat.

« L'interdisciplinarité a guidé mon activité scientifique jusqu'à présent et je suis convaincu qu’elle sera essentielle pour résoudre les problèmes auxquels notre monde fait face, que ce soit pour le développement d'une médecine innovante, l'invention d'énergies renouvelables ou la conception de matériaux durables. » Arnaud Gautier

« Pour pouvoir relever ces défis, les scientifiques auront besoin des apports des sciences physiques et des sciences du vivant, ainsi que d’une collaboration étroite entre ces disciplines. » témoigne avec conviction Arnaud Gautier, au parcours partagé entre la chimie et la biologie moléculaire.

« Il semblerait assez artificiel de cantonner nos questions de recherche à un champ disciplinaire dédié, alors que le monde que l’on étudie intègre l’ensemble de ces questions. » Alice Lebreton

Pour Alice Lebreton, « le cloisonnement en disciplines est une commodité, entre autres pour structurer les apprentissages mais aller vers plus d’interdisciplinarité est indispensable pour aborder la complexité du réel. La motivation est donc là par essence… Plus que d’encourager l’interdisciplinarité, peut-être s’agit-il surtout de ne pas la décourager. Les incitations existent, mais gagneraient probablement à être moins formelles, plus souples, pour laisser émerger les idées et les interactions plutôt que de les forcer en favorisant des consortia d’opportunisme. Notre collaboration s’est ainsi construite « malgré » les financements incitatifs, sur d’autres fonds et en marge de nos autres projets, afin d’explorer ensemble ce sujet. »

(1) L’oligomérisation est lorsqu‘un groupe de molécules de base chimique différente se lient pour former une molécule plus grande.
(2) La liaison covalente représente un type particulier de liaison chimique. Elle correspond à la liaison entre deux atomes, généralement non métalliques, résultant de la mise en commun d'électrons provenant séparément de chacun d'eux. Ainsi, chaque atome gagne en électrons. Source : Futura-sciences
(3) Le ligand est une molécule caractérisée par sa tendance à se lier à une autre.
(4) Le Dalton (Da) est une unité de masse des atomes.

Bibliographie

1. Caroline Peron-Cane (Laboratoire de Physique de l’École normale supérieure, ENS, Université PSL, CNRS, Sorbonne Université, Université de Paris, Institut de biologie de l’ENS (IBENS), École normale supérieure-PSL, CNRS, INSERM, Université PSL) José-Carlos Fernandez (IBENS, ENS-PSL, CNRS, INSERM, Université PSL), Julien Leblanc (IBENS, ENS-PSL, CNRS, INSERM, Université PSL), Laure Wingertsmann (IBENS, ENS-PSL, CNRS, INSERM, Université PSL), Arnaud Gautier (Sorbonne Université, ENS-PSL, Université PSL, CNRS, Laboratoire des Biomolécules, LBM, Institut Universitaire de France,) Nicolas Desprat (LPENS, ENS, Université PSL, CNRS, Sorbonne Université, Université de Paris, IBENS, ENS-PSL CNRS, INSERM, Université PSL, UFR de Physique, Université Paris-Diderot, Université de Paris), Alice Lebreton (ENS-PSL, CNRS, INSERM, Université PSL, INRAE, IBENS), Fluorescent secreted bacterial effectors reveal active intravacuolar proliferation of Listeria monocytogenes in epithelial cells, 12 octobre 2020, PLOS Pathogen, doi : 10.1371/journal.ppat.1009001.

2. Yankel Chekli (Genetics of Biofilms Laboratory, Institut Pasteur, UMR CNRS2001, Université de Paris, Sorbonne Paris Cité), Caroline Peron-Cane, Dario Dell’Arciprete (Laboratoire de Physique de l’ENS, ENS-PSL, Université PSL, CNRS, Sorbonne Université, Université de Paris), Jean-François Allemand (Laboratoire de Physique de l’ENS, ENS-PSL, Université PSL, CNRS, Sorbonne Université, Université de Paris), Chenge Li (Sorbonne Université, ENS-PSL, Université PSL, CNRS, LBM), Jean-Marc Ghigo (Genetics of Biofilms Laboratory, Institut Pasteur, UMR CNRS2001), Arnaud Gautier, Alice Lebreton, Nicolas Desprat, Christophe Beloin (Genetics of Biofilms Laboratory, Institut Pasteur, UMR CNRS2001). Visualizing the dynamics of exported bacterial proteins with the chemogenetic fluorescent reporter FAST. Sci Rep (2020) 10:15791. Doi : 10.1038/s41598-020-72498-2.