Jeanne Balibar entre à l’École normale supérieure en 1987. Elle décroche par la suite une bourse pour commencer une thèse d’histoire en Angleterre, où elle vivra trois ans.
Passionnée par l’art dès son plus jeune âge, c’est en 1991 qu’elle intègre le Cours Florent, puis le Conservatoire National Supérieur d'Art Dramatique l’année suivante. Rapidement remarquée, notamment au Festival d’Avignon où elle interprète le personnage d’Elvire dans Don Juan, elle rejoint la Comédie Française en 1993. Elle la quitte en 1997 pour s’ouvrir d’avantage au cinéma. Elle est reconnue comme une figure du cinéma d’auteur pour ses rôles dans Comment je me suis disputé… (ma vie sexuelle) (1996) d'Arnaud Desplechin ou encore J'ai horreur de l'amour (1997) de Laurence Ferreira Barbosa. En 1998, elle reçoit le prix de la meilleure actrice au Festival de San Sebastian pour son rôle dans Fin août, début septembre d'Olivier Assayas. Bilingue en allemand, elle joue également dans des pièces comme La Cousine Bette en 2014 ou Les Frères Karamazov en 2015, adaptations de Frank Castorf.
En parallèle, elle chante lors de concerts de soutien comme en 1999 pour le Groupe d'information et de soutien des immigrés (GISTI) où elle interprétera Les Petits Papiers de Serge Gainsbourg. En 2003 sort son premier album Paramour. Elle chante également pour des films comme Le Bal des actrices de Maïwenn.
Elle est nommée au César de la meilleure actrice dans un second rôle en 2001 pour le film Ça ira mieux demain de Jeanne Labrune et pour Sagan en 2009 de Diane Kurys.
Elle reçoit également une « mention spéciale » en 2012 lors du Prix Jean-Vigo pour la réalisation de son premier film Par exemple, Électre en collaboration avec Pierre Léon.
En 2018, elle obtient le César de la meilleure actrice pour son interprétation dans le film Barbara de Mathieu Amalric.